ROS流式分析

一、服務(wù)簡介：

目前檢測細胞內(nèi)ROS水平常用的是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA可以自由穿過細胞膜，本身沒有熒光。細胞內(nèi)的酯酶可將DCFH-DA水解生成不能通過細胞膜的DCFH，這樣使得探針在細胞內(nèi)形成積聚。經(jīng)過經(jīng)細胞內(nèi)ROS的氧化，DCFH可轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒獾腄CF，且熒光的強度與ROS的水平成正比。

二、樣本要求及實驗流程：

• 準備細胞：將目的細胞均勻鋪至六孔板中，實驗組和對照組分別做相應(yīng)處理，并預(yù)設(shè)空白管（即不裝載探針）。至細胞密度達到80%-95%。
• 清洗：用PBS將六孔板中細胞分別清洗1-2次，并棄去PBS。
• 消化：用胰酶將六孔板中細胞消下來，移至1.5mlEP管中，并做好標記。
• 離心：1200r，常溫，離心5min。
• 探針配制：按照2μl DCFH-DA原液：3ml無血清培養(yǎng)基配制，上下顛倒混勻（注意避光）。
• 加入探針：棄去4中培養(yǎng)基，空白管加入1ml無血清培養(yǎng)基，其余均加入1ml配制好的探針液，并重懸細胞（注意避光）。
• 孵育：37°C避光孵育20min。
• 離心：1200r，常溫，離心5min，棄去上清。
• 清洗：用1ml冷PBS清洗，1200r，常溫，離心5min，棄去上清，重復(fù)2次（注意避光）。
• 上機：將細胞用500μl冷PBS重懸，并移至流式管，上機。


• 注意事項：
• 1、消化細胞時，以細胞剛好掉落為好，不可時間過長，避免過度消化造成細胞損傷而影響實驗結(jié)果。
• 2、探針配置時，一般按照1：1000用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA（終濃度為10Μm），不同的細胞系條件有所不同，需自行摸索。
• 3、加入探針后，一定要充分混懸細胞，以保證探針完全結(jié)合。
• 4、探針孵育時，每隔3-5min需顛倒混勻。
• 5、探針孵育時間不同細胞可能會不一樣，一般為20-30min。
• 6、最佳激發(fā)波長為488nm，最佳發(fā)射波長為525nm。