原代細胞難轉(zhuǎn)染怎么辦？

　　原代細胞轉(zhuǎn)染比常規(guī)小核酸轉(zhuǎn)染更困難。以下原代細胞廠家的小編分享了有關(guān)原代細胞轉(zhuǎn)染的一些注意事項。希望能夠幫助到大家。

　　使用RFect系列小分子核酸轉(zhuǎn)染試劑進行siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染檢測實驗時的注意事項：

　　1、細胞接種：通常在轉(zhuǎn)染前1天進行接種/鋪板(細胞數(shù)約為5*10^4個細胞/ml)，轉(zhuǎn)染前細胞密度為30～50%。如果細胞是原代細胞，接種密度將為：細胞數(shù)為2*10^6細胞/ml。在細胞狀況穩(wěn)定后，可以在轉(zhuǎn)染當天接種/接種漂浮細胞(細胞計數(shù)約為 5 * 10 ^ 4 個細胞/毫升)。轉(zhuǎn)染前細胞密度為30-40%。

　　2、初次使用建議使用24孔板，以增強使用過程中的轉(zhuǎn)染效果。每孔使用 2 ul 轉(zhuǎn)染試劑。只需將好的轉(zhuǎn)染條件(siRNA 和轉(zhuǎn)染試劑的數(shù)量和比例)擴展到相應(yīng)的孔板。

　　3. 將siRNA終濃度的四個梯度設(shè)置為10nM、30nM、50nM和100nM。應(yīng)該在每個梯度中創(chuàng)建幾個重復(fù)的孔(至少兩個重復(fù)的孔以避免實驗錯誤)。

　　4. 用于稀釋siRNA和轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基必須是無血清培養(yǎng)基，因為血清的存在會干擾siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的混合，影響轉(zhuǎn)染效率。

　　5、檢測方法：轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞進行qPCR基因水平檢測。轉(zhuǎn)染72小時后，收集細胞進行蛋白質(zhì)提取，用于Western blotting蛋白水平檢測。