超詳細(xì):WB 常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

1. 免疫印跡

蛋白質(zhì)印跡或免疫印跡 (Western blot，簡(jiǎn)稱 WB) 是一種常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室方法，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)并評(píng)估其表達(dá)水平。根據(jù)其分子量和與特定抗體的免疫反應(yīng)性來(lái)鑒定感興趣的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡由一系列相互關(guān)聯(lián)的步驟組成 (圖 1)。

蛋白質(zhì)印跡相互關(guān)聯(lián)步驟：

(1) 將樣品 (通常是蛋白質(zhì)混合物) 加載到凝膠上。Marker 標(biāo)記包含各種已知分子量的預(yù)標(biāo)記蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)樣品一起加載到凝膠上作為尺寸參考。

(2) 凝膠電泳用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量來(lái)分離蛋白質(zhì)。

(3) 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移或“印跡”到膜上。

(4) 封閉膜以減少非特異性結(jié)合，然后依次用特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白的一抗和二抗進(jìn)行探測(cè)。后者結(jié)合一抗并攜帶允許隨后檢測(cè)的酶或熒光團(tuán)。

(5) 分別通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)或熒光檢測(cè)信號(hào)。

(6) 準(zhǔn)備蛋白質(zhì)印跡圖像以供發(fā)表。

由于該實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、細(xì)節(jié)多，從樣品制備到顯影，每個(gè)步驟中都可能存在問(wèn)題，最后得到的條帶往往千奇百怪、不盡人意……在這篇推文中，我們將為您介紹一些常見(jiàn)的 WB 實(shí)驗(yàn)問(wèn)題以及相應(yīng)的解決方案。

2. 免疫印跡常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

2.1 問(wèn)題一：背景高

2.2 問(wèn)題二：信號(hào)弱或完全缺失

2.3 問(wèn)題三：出現(xiàn)“非特異性”條帶、多帶等現(xiàn)象

2.4 其他問(wèn)題

2.4.1. 微笑條帶：

可能性原因：遷移過(guò)快、電泳緩沖液溫度偏高、蛋白質(zhì)超載或孔內(nèi)運(yùn)行緩沖液不足。
建議：應(yīng)降低遷移速度、預(yù)冷緩沖液、減少蛋白上樣量、緩沖液完全覆蓋孔，確保內(nèi)室緩沖液不會(huì)泄露到外室[4][6]。

2.4.2. 皺眉條帶：

可能性原因：裝置不合適，可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。

建議：可通過(guò)調(diào)整裝置來(lái)避免該問(wèn)題。

2.4.3. 條帶拖尾：

可能性原因：樣品溶解不好；存在一定程度地蛋白降解；電泳液反復(fù)多次使用。

建議：樣品充分溶解混勻后上樣；盡量使用新鮮樣本；使用新鮮配制的電泳緩沖液。

2.4.4. 啞鈴狀不均勻條帶：

可能性原因：配置膠有問(wèn)題，膠凝固后不均一；樣品可能含有過(guò)多雜質(zhì)。建議：重新配置膠，確保膠質(zhì)量無(wú)問(wèn)題來(lái)避免該現(xiàn)象出現(xiàn)；在樣品使用前離心。

2.4.5. 條帶粘連：

可能性原因：可能是上樣量太多，或者是制膠問(wèn)題，分離膠和濃縮膠之間有間隙，樣品竄孔。建議：可通過(guò)減少上樣量和提高配膠質(zhì)量來(lái)避免。

2.4.6. 條帶空泡：

可能性原因：轉(zhuǎn)膜時(shí)膜上有氣泡建議：確保在組裝“三明治”時(shí)，移除凝膠和印跡膜間的所有氣泡。

2.4.7. 背景有不均勻的黑色斑點(diǎn)：

可能性原因：封閉液未完全溶解，使不容顆粒附著在膜上從而導(dǎo)致發(fā)光時(shí)候膜上形成黑點(diǎn)；或抗體在膜上分布不均；

建議：封閉液一定要充分溶解，封閉結(jié)束之后要用 TBST清洗三遍再加一抗；抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)。

2.4.8. 條帶空斑：

可能性原因：目的蛋白條帶中間空白，周圍背景正常。該現(xiàn)象可能是一抗二抗?jié)舛冗^(guò)高，促使底物過(guò)快消耗，從而導(dǎo)致在進(jìn)行化學(xué)發(fā)光時(shí)，底物耗盡形成空斑。