詳細介紹下原代細胞的復蘇步驟

　　細胞通常在-196°C的溫度下存儲在液氮中，理論上具有無限的存儲時間。細胞冷凍和復蘇的基本原理是緩慢冷凍和快速解凍。實驗表明，這可以顯著維持細胞活力。細胞恢復是將原本冷凍保存(凍結(jié))的細胞恢復為正常增殖狀態(tài)的過程，今天我們來看看原代細胞的復蘇步驟。

　　一、檢查

　　收到細胞系包裝時，請檢查細胞系冷凍管是否已解凍。 如果已解壓縮，請立即處理并告知發(fā)件人。盡快開始培養(yǎng)細胞系或立即冷凍(在–70°C下儲存過夜并轉(zhuǎn)移到溶液N2中)。

　　二、冷凍細胞解凍

　　1.根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型，血清類型以及細胞系聲明中指定的其他指定成分和比率，準備培養(yǎng)基。

　　大多數(shù)細胞不能輕易適應不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同類型的血清。如果由于實驗的需要而有所不同，請緩慢而逐漸地改變培養(yǎng)基的成分。細胞適應并進行必要的實驗。

　　2. FBS(胎牛血清)，CS(小牛血清，小牛血清)，HS(馬血清，馬血清)因細胞而異。確保根據(jù)細胞系信息中列出的血清類型培養(yǎng)細胞。

　　3.將培養(yǎng)基放入37°C的水箱中加熱，用70%的酒精噴灑，加熱后擦去，然后將其轉(zhuǎn)移到無菌手術(shù)臺上。取下冷凍管，立即將其放入37°C的水箱中以快速融化。水位不應接近或高于冷凍管的蓋子。否則，很可能發(fā)生污染。輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)完全溶解，用70%的乙醇擦拭冷凍管的外部，然后移至無菌手術(shù)臺上。

　　4.根據(jù)細胞類型和濃度，在無菌手術(shù)臺上的T25或T75燒瓶中加入10 ml培養(yǎng)基。取出融化的細胞懸液，緩慢地將培養(yǎng)基添加到T25或T75燒瓶中，充分混合，然后在5%CO2孵育箱中于37°C孵育。

　　5.在大多數(shù)細胞中，少于1%的防凍DMSO不會對細胞附著或激活產(chǎn)生不利影響。不需要立即將其從解凍的細胞中取出。第二天確認細胞生長或附著。卸下后將其牢固安裝。

　　對于非常少數(shù)對DMSO敏感或引起細胞分化的細胞，如果需要立即去除DMSO，請將解凍的細胞懸液置于5-10 ml培養(yǎng)基和300 xg(約)中，以1000 rpm離心5分鐘，然后小心取出。向上清液中添加適量的新鮮培養(yǎng)基，將細胞均勻混合，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，并在5%CO2培養(yǎng)箱中于37°C孵育。

　　3.如何處理T25燒瓶細胞

　　1.在運輸過程中，用培養(yǎng)基填充所有T25燒瓶，以防止起泡，細胞脫落和死亡。檢查燒瓶的外觀，并在顯微鏡下觀察細胞生長和污染。如果有問題，請勿打開蓋子。請立即與細胞實驗室聯(lián)系。

　　2.將原始的T25燒瓶放入37°C的5%CO2培養(yǎng)箱中，將細胞加熱至37°C，然后重新附著并增殖在運輸過程中脫落的少量細胞。

　　第二天，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)物移至無菌技術(shù)箱中(去除的培養(yǎng)基可重復使用)，留出約5-10 ml進行基于培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)，然后根據(jù)常規(guī)方法將細胞置于培養(yǎng)箱中?；蛘撸绻毎┻^板，則將細胞傳代培養(yǎng)。

　　四，細胞復蘇注意事項

　　1.在整個恢復過程中更加靈活。如果前面太長，可能會影響愈合效果。

　　2.使用鑷子，因為“除冰”過程中冷凍管與水之間的溫差太大，尤其是液氮冷凍保存管，浸入水中會影響視力。冷凍管。將沉淀管推入水中，以便即使破裂也可以作為緩沖液存在。

　　3.小心凍傷，尤其是在夏天卸下冷凍管時。盡管有熱量，還是需要穿上長袖的實驗室外套。疏忽大意的運動會導致一小塊新鮮的肉“粘”在冰箱門上。

　　4.離心步驟也可以在冷凍管中的冰融化后立即進行。也就是說，將冷凍管直接離心，離心后將原來的冷凍保存液丟棄，然后直接添加完全培養(yǎng)基以重懸細胞。將細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿/燒瓶中進行培養(yǎng)。此方法可能無法干凈地除去DMSO，但效果不大。

　　5.不要忘記在恢復的第二天檢查細胞。如果條件良好，則恢復成功。