角質(zhì)形成細(xì)胞分離的常用方法

　　原代細(xì)胞在相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用過(guò)程中越來(lái)越多，人們不再單單趨于使用細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，因?yàn)?a astyle_h="1" _t="103" _i="AGcI/////w8SF2h0dHA6Ly93d3cuc2hpY2VsbC5jb20vGAA=" _n="http://www.shicell.com/" target="_blank" textvalue="細(xì)胞">細(xì)胞系常常由于體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，而容易丟失原有的生物學(xué)特性，對(duì)藥物處理的反應(yīng)差距越來(lái)越大。為了更好的服務(wù)于廣大科研工作者，我司技術(shù)人員特提供了角質(zhì)形成細(xì)胞分離的常用方法。

　　1.新鮮的表皮組織，裝盛于含有無(wú)菌生理鹽水或1×PBS的無(wú)菌容器中，于保溫盒中，冰上放置離體6h內(nèi)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分離。

　　2.在無(wú)菌環(huán)境中取出表皮組織，用1×PBS清洗2-3次去除表面血液后，75%的酒精浸泡100s

　　3.酒精浸泡組織后快速將組織轉(zhuǎn)入裝有1×PBS的培養(yǎng)皿中震蕩清洗數(shù)次以去除酒精，然后用眼科剪小心剪去皮下組織(脂肪，微血管等)

　　4.將去除了脂肪和微血管組織的再用1×PBS清洗幾次后，剪成3mm*8mm左右的皮片，用消化液1 4度消化過(guò)夜(15-18h)。

　　5.第二天，用2個(gè)眼科鑷子小心撕開(kāi)過(guò)夜消化的皮膚組織，分離和表皮;

　　6.分離的表皮用眼科剪剪碎后用消化液3 37度水浴消化1h。

　　7.消化完成后用移液器充分吹打100次左右，然后用含血清的培養(yǎng)基終止消化，過(guò)200目不銹鋼網(wǎng)篩后取濾懸液，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，400g離心10分鐘，離心完成后棄去上清，沉淀用3ml的1×PBS吹打重懸后，400g離心5min離心完成后棄去上清，沉淀用2ml的原代角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基吹打重懸后，轉(zhuǎn)入已經(jīng)裝有2ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　8.視細(xì)胞貼壁情況48-72h后換液去除未貼壁的細(xì)胞，之后繼續(xù)培養(yǎng)，視細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和培養(yǎng)基顏色每2-3d換液一次;待細(xì)胞貼壁率達(dá)到80-90%后，進(jìn)行常規(guī)傳代擴(kuò)增操作(角質(zhì)細(xì)胞對(duì)胰酶不太敏感，消化時(shí)間可能會(huì)增加到10-15分鐘，有時(shí)需要配合使用無(wú)菌細(xì)胞刮鏟進(jìn)行傳代)。