詳細(xì)介紹如何繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線？

　　一個(gè)典型的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以分為四個(gè)部分：潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期、平頂期和退行性老化，其中三個(gè)不同的生長(zhǎng)期(潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期、平頂期)是每個(gè)細(xì)胞系所共有的特征。通過(guò)測(cè)量增殖曲線，我們了解培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)，確定細(xì)胞增殖的絕對(duì)數(shù)，確定細(xì)胞活力，而且也可用于測(cè)定藥物等外來(lái)因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

　　1.實(shí)驗(yàn)材料

　?、偈筇コ衫w維細(xì)胞或雞胚胎成纖維細(xì)胞，完全DMEM培養(yǎng)基，0.25%胰脂肪酶。

　　② 24孔板細(xì)胞培養(yǎng)板、移液管、吸球、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)板。

　　2.操作步驟

　?、偈占鲋碃顟B(tài)良好的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞或雞胚胎成纖維細(xì)胞，用胰蛋白酶消化。

　　②用DMEM制備細(xì)胞懸液。計(jì)算細(xì)胞數(shù)后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為 (1-5) x 104 個(gè)細(xì)胞/mL，并將細(xì)胞準(zhǔn)確接種到兩個(gè) 24 孔板中。添加到每個(gè)孔中的細(xì)胞總數(shù)和數(shù)量應(yīng)該相同。添加的培養(yǎng)基量應(yīng)相同。

　?、勖刻煜?孔細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。 通常，您需要連續(xù)計(jì)算大約 10 天。從培養(yǎng)開(kāi)始，未計(jì)數(shù)的細(xì)胞應(yīng)每 3 天更換一次。

　　④以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞濃度為縱軸，將每天獲得的細(xì)胞濃度寫(xiě)在方格紙上，并連點(diǎn)得到細(xì)胞增殖曲線。

　　3.注意事項(xiàng)

　?、偌?xì)胞接種濃度不宜過(guò)高或過(guò)低。在適當(dāng)?shù)臐舛认?，?xì)胞將在 7-10 天內(nèi)生長(zhǎng)而不會(huì)受到生長(zhǎng)抑制。如果小區(qū)數(shù)量太少，小區(qū)適應(yīng)周期就會(huì)太長(zhǎng)。如果數(shù)量過(guò)多，細(xì)胞很快就會(huì)進(jìn)入穩(wěn)定增值期，需要在一定時(shí)間內(nèi)傳代，曲線不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。應(yīng)在相同接種密度下連續(xù)測(cè)定同種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行縱向比較。不同的細(xì)胞應(yīng)接種相同數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行比較。

　　②細(xì)胞增殖曲線是觀察細(xì)胞增殖基本規(guī)律的重要方法。只有具有獨(dú)特和穩(wěn)定增殖特性的細(xì)胞才能用于實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖的變化。因此，確定生長(zhǎng)曲線是觀察細(xì)胞系細(xì)胞和未建立細(xì)胞生長(zhǎng)特性的最基本指標(biāo)。

　?、奂?xì)胞生長(zhǎng)曲線最常用，但其反映值可能不夠準(zhǔn)確，存在20%～30%的誤差，需結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)行分析。生長(zhǎng)曲線上細(xì)胞數(shù)加倍所需的時(shí)間稱(chēng)為細(xì)胞倍增時(shí)間，可由曲線計(jì)算。細(xì)胞倍增時(shí)間間隔是細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期，大多數(shù)細(xì)胞傳代、冷凍等實(shí)驗(yàn)都應(yīng)在此間隔進(jìn)行。

　?、懿煌囵B(yǎng)物中細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞倍增時(shí)間可以直接反映培養(yǎng)物中細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，是選擇培養(yǎng)物的主要依據(jù)。相同培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的差異為成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞選擇最合適的培養(yǎng)基。

　?、萃ㄟ^(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，可以比較不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線變化的影響。如果條件允許，我們會(huì)分析在培養(yǎng)基中加入各種生物活性物質(zhì)(生長(zhǎng)因子、激素等)對(duì)細(xì)胞增殖的影響，以選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)基。