原代細(xì)胞的分離方法都有哪些

　　人體或動物體(或胚胎組織)與各種細(xì)胞緊密結(jié)合，在體外不會導(dǎo)致單個細(xì)胞的生長和再生?，F(xiàn)有的組織塊需要完全分散以分離細(xì)胞。

　　1. 分離漂浮細(xì)胞的方法

　　如果組織材料來自血液、羊水、胸腔積液或腹水的懸浮液，簡單的方法是進(jìn)行 1000 r/min 緩慢離心 10 分鐘。離心后，不同密度的不同細(xì)胞在分層溶液中形成不同的層，允許根據(jù)需要收獲感興趣的細(xì)胞。

　　2、實(shí)體組織材料的分離方法

　　在固體組織材料的情況下，細(xì)胞是緊密結(jié)合的，所以采用機(jī)械分散(物理裂解)和消化分離的方法，使組織內(nèi)的細(xì)胞完全分散，形成細(xì)胞懸液，可以使用。

　?、?機(jī)械分散法

　　特點(diǎn):簡便、快速,但對組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。

　　② 消化分離法

　　組織消化將組織分成更小的團(tuán)塊(或糊狀物)，并利用酶的生化和非酶促化學(xué)作用，進(jìn)一步松開細(xì)胞間的橋梁結(jié)構(gòu)，使團(tuán)塊變大并結(jié)塊。此時，可采用機(jī)械方法通過移液或電磁攪拌或在搖瓶中振動的方式分散細(xì)胞團(tuán)，分散少量細(xì)胞團(tuán)和大量單細(xì)胞。細(xì)胞懸液可制成細(xì)胞，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞更容易貼壁。

　?、?酶消化分離法

　　酶消化分離法常采用胰蛋白酶(Corning 25-053-CI)和膠原酶(Sigma/Life)

　　胰蛋白酶是胰腺的產(chǎn)物，對蛋白質(zhì)具有水介導(dǎo)作用，主要作用于與賴氨酸和精氨酸結(jié)合的肽鍵，介導(dǎo)細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)與水和分散細(xì)胞。

　　膠原酶是從細(xì)菌中提取的一種酶，對膠原蛋白有很強(qiáng)的消化作用。適用于纖維組織、上皮組織、癌組織的消化，對細(xì)胞間質(zhì)的消化效果非常好。

　　除了上面列出的兩種常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白、蝸牛酶、彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶。

　?、?非酶消化法(EDTA消化法)

　　EDTA 是一種非酶消化物，也稱為螯合劑或 Versene，其正式名稱為乙二胺四乙酸。常用無鈣鎂離子的PBS配制0.02%工作液。這對一些組織，尤其是上皮組織有很好的分散作用。 這種化學(xué)物質(zhì)可以與細(xì)胞上的鈣和鎂離子結(jié)合形成螯合物。機(jī)械力環(huán)繞細(xì)胞并分散它們，或從瓶壁去除貼壁細(xì)胞。

　　Ⅲ 消化分離法的操作步驟

　　剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機(jī)械分散

　?、?消化分離法的注意事項(xiàng)

　　組織塊應(yīng)沖洗2-3次，以去除鈣、鎂離子和血清對組織中胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。

　　胰蛋白酶濃度不宜過高，作用時間不宜過長，以免產(chǎn)生毒性作用。

　　消化后，不僅要盡量將消化液倒掉以免中毒，而且動作要輕，以免因沖洗造成大塊細(xì)胞流失。